qPCR, DNA veya RNA’nın çoğaltma sürecini gerçek zamanlı olarak izleyebilen hassas bir moleküler analiz tekniğidir. Amplifikasyon sırasında oluşan floresan sinyal, hedef nükleik asidin miktarını döngü bazında takip etmeyi mümkün kılar. Bu nedenle qPCR, hem tanıda hem de gen ekspresyon çalışmalarında en güvenilir kantitatif yöntemlerden biri olarak kabul edilir.
qPCR yöntemi, klasik PCR’ın temel prensiplerini korurken floresan tabanlı ölçüm sistemleri sayesinde numunedeki genetik materyalin miktarını sayısal olarak belirleyebilir. Klinik örneklerde viral yükün izlenmesi, belirli bir genin ne kadar ifade edildiğinin ölçülmesi ve kantitatif doğruluk gerektiren tüm moleküler çalışmalar bu teknikle yürütülebilir.
qPCR’ın Temel Çalışma Prensibi
qPCR cihazları, DNA amplifikasyonunu her döngüde oluşan floresan sinyal üzerinden takip eder. Floresan işaretleyiciler, DNA sentezlendikçe artan bir ışık yoğunluğu üretir ve cihaz bu yoğunluğu grafiksel olarak kaydeder.
Ct Değeri
Amplifikasyon eğrisinin eşik noktasına ulaştığı döngü sayısı Ct (Cycle Threshold) olarak tanımlanır. Ct değeri ne kadar düşükse, başlangıçtaki hedef DNA miktarı o kadar yüksektir. Bu değer, qPCR’ın kantitatif yönünün temelini oluşturur.
Kullanılan Floresan Sistemleri
İki ana floresan yaklaşımı bulunur:
- DNA boyaları (SYBR Green gibi)
Çift zincirli DNA’ya bağlanarak sinyal oluşturur. - Prob tabanlı sistemler (TaqMan gibi)
Spesifiteyi artırır ve hedef dizinin doğruluğundan emin olmayı sağlar.
qPCR Aşamaları
- Transkripsiyon veya Direkt DNA Hazırlığı
Eğer hedef RNA ise süreç RT-qPCR şeklinde başlar; RNA önce cDNA’ya dönüştürülür. Eğer DNA analiz edilecekse bu aşamada doğrudan amplifikasyona geçilir.
*2. Amplifikasyon
Hazırlanan reaksiyon karışımı qPCR cihazına yerleştirilir. Cihaz, döngü boyunca ısı değişimleri uygulayarak DNA’nın çoğalmasını sağlar.
- Floresan Ölçümü
Her döngü sonunda floresan şiddeti artır ve cihaz amplifikasyon eğrisini oluşturur. Bu eğri, hedef nükleik asidin miktarını doğrudan yansıtır.
qPCR’ın Sağladığı Avantajlar
Yüksek Hassasiyet
Düşük miktardaki genetik materyali bile tespit edebilir. Viral yük araştırmaları bu nedenle qPCR ile yapılır.
Gerçek Zamanlı İzleme
Reaksiyon sona ermeden DNA çoğalması takip edilebilir. Grafiksel veriler, süreç hakkındaki tüm detayları sunar.
Kantitatif Doğruluk
Ct değerleri ile hedef DNA miktarı hesaplanabilir. Bu, tedavi takibi ve ekspresyon analizi gibi çalışmalarda kritik önem taşır.
Spesifikite
Prob tabanlı sistemler yanlış pozitif riskini azaltır. Tasarımı doğru yapılmış bir qPCR reaksiyonu oldukça güvenilir sonuç verir.
qPCR’ın Kullanım Alanları
- Gen ekspresyon analizleri
Bir genin ne kadar aktif olduğunu belirlemek için en standart yöntemdir. - Viral yük ölçümü
HIV, HBV, CMV gibi enfeksiyonlarda viral kopya sayısının belirlenmesinde kullanılır. - Mutasyon ve varyant tespiti
Allel-spesifik problar ile belirli mutasyonların varlığı hızlıca saptanabilir. - Klinik tanı
Numunelerdeki patojen miktarı, tedavi yanıtı veya hastalık ilerleyişi qPCR ile takip edilebilir.
qPCR’da Sonuçları Etkileyen Faktörler
Primer tasarımı, numune saflığı, reaksiyon verimliliği ve kullanılan floresan sisteminin kalitesi qPCR sonuçlarının doğruluğunu belirler. Numunenin kontaminasyondan uzak olması, RNA çalışmaları için RNaz kontrolü ve cihaz kalibrasyonlarının düzenli yapılması analiz hassasiyeti açısından büyük önem taşır.
Avaks ile Profesyonel qPCR Analizleri
Gen ekspresyonu, viral yük veya kantitatif DNA ölçümleri için güvenilir qPCR çalışmalarına ihtiyaç duyuyorsanız, Avaks’ın uzman ekibi laboratuvar süreçlerinizde yüksek doğrulukta sonuçlar sunar.
