Real Time PCR Nedir?, DNA’nın çoğaltılması sırasında oluşan ürün miktarını eş zamanlı olarak ölçebilen gelişmiş bir moleküler biyoloji tekniğidir. Real Time PCR Nedir? sorusu, özellikle genetik analizler, hastalık teşhisi ve biyoteknolojik araştırmalar açısından oldukça kritik bir yöntemi ifade eder. Bu teknik, klasik PCR’dan farklı olarak sadece DNA’yı çoğaltmakla kalmaz, aynı zamanda oluşan ürün miktarını floresan sinyaller aracılığıyla anlık olarak takip etme imkanı sunar.
Real Time PCR Nedir?, özel floresan problar ve sensörler kullanılarak DNA amplifikasyonunun her döngüsünde ölçüm yapılmasını sağlayan bir sistemdir. Real Time PCR Nedir? sorusunun yanıtı, modern laboratuvarlarda hızlı, hassas ve güvenilir analizler yapılabilmesini sağlayan bir teknoloji olarak da açıklanabilir. Bu yöntem sayesinde enfeksiyon hastalıklarının erken teşhisi, gen ekspresyon analizleri ve kantitatif DNA ölçümleri yüksek doğrulukla gerçekleştirilmektedir.
Real Time PCR
Real Time PCR, DNA veya RNA örneklerinin çoğaltılmasını ve oluşan ürün miktarının işlem sırasında gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlayan moleküler analiz yöntemidir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu olarak da bilinen bu yöntem; klinik tanı, genetik araştırmalar, mikrobiyoloji, gıda analizleri, veterinerlik ve biyoteknoloji çalışmalarında yaygın şekilde kullanılır.
Klasik PCR yönteminde çoğaltılan genetik materyal işlem tamamlandıktan sonra değerlendirilirken Real Time PCR uygulamasında amplifikasyon süreci floresan sinyaller aracılığıyla her döngüde izlenebilir. Numunedeki hedef nükleik asit miktarı arttıkça cihaz tarafından algılanan floresan sinyal de yükselir. Böylece hedef DNA veya RNA’nın varlığı ve başlangıç miktarı hakkında bilgi elde edilebilir.
RNA analizlerinde genellikle ilk olarak ters transkripsiyon işlemi uygulanır ve RNA, tamamlayıcı DNA’ya dönüştürülür. Ardından elde edilen DNA, Real Time PCR cihazında çoğaltılarak analiz edilir. Bu yöntem RT-qPCR veya Real Time RT-PCR olarak adlandırılabilir. Kullanılan uygulamaya göre prob tabanlı ya da floresan boya tabanlı farklı analiz sistemleri tercih edilebilir.
Real Time PCR analizinin temel bileşenleri arasında şunlar bulunur:
- Analiz edilecek DNA veya RNA örneği
- Hedef bölgeye uygun primerler
- Floresan boya veya işaretli prob
- DNA polimeraz enzimi
- Nükleotidler
- Reaksiyon tamponu
- Pozitif ve negatif kontroller
- Real Time PCR cihazı
Analiz sırasında cihaz, reaksiyon tüplerindeki floresan değişimini ölçerek amplifikasyon eğrileri oluşturur. Sonuçların güvenilir olması için örnek hazırlama işleminin doğru yapılması, kontaminasyon riskinin azaltılması ve uygun kontrol örneklerinin kullanılması gerekir. Pipetleme hataları, numune kalitesinin düşük olması veya reaksiyon bileşenlerinin uygun koşullarda saklanmaması sonuçları etkileyebilir.
Real Time PCR Sonuç Değerlendirme
Real Time PCR sonuç değerlendirme işlemi, cihazın oluşturduğu amplifikasyon eğrileri ve Ct ya da Cq değerleri üzerinden gerçekleştirilir. Ct değeri, floresan sinyalin belirlenen eşik seviyesini geçtiği döngü sayısını ifade eder. Numunede başlangıçtaki hedef genetik materyal miktarı yüksek olduğunda eşik değeri daha erken geçilir ve daha düşük bir Ct değeri elde edilir.
Yüksek Ct değerleri, numunedeki hedef nükleik asit miktarının daha düşük olabileceğini gösterebilir. Ancak Ct değerlerinin tek başına pozitif veya negatif sonuç olarak değerlendirilmesi doğru değildir. Kullanılan test kiti, cihaz, analiz protokolü, örnek türü ve üretici tarafından belirlenen sınır değerler birlikte dikkate alınmalıdır.
Real Time PCR sonucunun değerlendirilmesinde pozitif, negatif ve iç kontrol sonuçları kontrol edilmelidir. Pozitif kontrolün beklenen şekilde amplifikasyon göstermesi, test bileşenlerinin ve reaksiyon koşullarının uygun çalıştığını destekler. Negatif kontrolde amplifikasyon görülmemesi gerekir. Negatif kontrolde sinyal oluşması, kontaminasyon veya reaksiyon hazırlama hatası ihtimalini gösterebilir.
İç kontrol ise numune hazırlama, ekstraksiyon ve amplifikasyon süreçlerinin doğru çalışıp çalışmadığının değerlendirilmesine yardımcı olur. İç kontrol sinyalinin alınamaması; PCR inhibitörlerinin bulunması, numune kalitesinin düşük olması veya işlem sırasında teknik bir sorun yaşanması gibi nedenlerden kaynaklanabilir. Bu durumda sonuç geçersiz kabul edilebilir ve analiz tekrarına ihtiyaç duyulabilir.
Sonuç değerlendirme sürecinde aşağıdaki kriterler incelenmelidir:
- Amplifikasyon eğrisinin şekli
- Ct veya Cq değeri
- Pozitif kontrol sonucu
- Negatif kontrol sonucu
- İç kontrol sonucu
- Tekrarlar arasındaki uyum
- Erime eğrisi analizi
- Test kitinin belirlediği eşik değer
- Numunenin kalitesi ve uygunluğu
Boya tabanlı Real Time PCR uygulamalarında erime eğrisi analizi de değerlendirilmelidir. Erime eğrisinde beklenen sıcaklıkta tek ve belirgin bir pik görülmesi, hedef ürüne özgü amplifikasyonu destekleyebilir. Birden fazla pik oluşması ise özgül olmayan ürünlerin veya primer dimerlerinin meydana geldiğini gösterebilir.
Real Time PCR sonuçları değerlendirilirken cihazdan alınan sayısal veriler mutlaka kullanılan kitin talimatları ve laboratuvarın doğrulanmış analiz prosedürleriyle birlikte yorumlanmalıdır. Klinik amaçlı testlerde sonuçların uzman personel tarafından değerlendirilmesi ve hastanın diğer laboratuvar bulguları ile klinik durumu dikkate alınarak yorumlanması gerekir.
Avakslab bünyesinde moleküler analiz çalışmalarına yönelik farklı laboratuvar cihazları ve sarf malzemeleri değerlendirilebilir. Real Time PCR uygulamalarına uygun laboratuvar çözümleri hakkında bilgi almak için Avakslab ile iletişime geçebilirsiniz.
