Real-Time PCR sonuç değerlendirme, genetik materyalin kantitatif olarak analiz edilmesini sağlayan en hassas yöntemlerden biridir. Bu analiz süreci, DNA veya RNA örneklerindeki hedef gen bölgelerinin ne kadar çoğaldığını ölçer. Real-Time PCR’da elde edilen sonuçlar, floresan sinyallerin döngü sayısına göre değerlendirilir ve bu sinyaller sayesinde örnekteki nükleik asit miktarı doğru şekilde tespit edilir.
Real-Time PCR sonuç değerlendirmesi, sadece pozitif ya da negatif bir sonuç belirlemez; aynı zamanda amplifikasyon eğrisinin şekline, Ct (Cycle Threshold) değerine ve referans gen karşılaştırmalarına göre analiz yapılır. Bu nedenle laboratuvar sürecinde cihaz kalibrasyonu, reaktif kalitesi ve örnek hazırlanışı gibi detaylar doğrudan sonuçların güvenilirliğini etkiler.
Ct Değeri Nedir ve Nasıl Yorumlanır?
Ct (Cycle Threshold) değeri, Real-Time PCR analizinde en kritik parametrelerden biridir. Ct değeri, floresan sinyalin belirli bir eşiği aştığı döngü sayısını ifade eder. Bu değer ne kadar düşükse, örnekteki hedef genin miktarı o kadar fazladır.
Genel olarak:
- Ct ≤ 30: Hedef gen yoğunluğu yüksek, pozitif sonuç
- Ct 30–35 arası: Orta düzeyde gen varlığı
- Ct ≥ 35: Düşük yoğunlukta hedef gen ya da negatif sonuca yakın örnek
Ancak bu yorumlar cihaz modeline, kullanılan master mix, prob tipi ve laboratuvar standartlarına göre farklılık gösterebilir. Bu yüzden her analiz, üretici protokolüyle uyumlu şekilde değerlendirilmelidir.
Eğri Analizi ve Kalite Kontrol
Amplifikasyon eğrisi, Real-Time PCR sonuçlarının doğruluğunu anlamada temel göstergedir. Doğru bir eğri, logaritmik fazda hızlı bir yükseliş gösterir ve ardından plato fazına ulaşır. Eğrinin bu formu, reaksiyonun düzgün ilerlediğini gösterir. Eğer eğride düzensizlik veya geç yükseliş varsa; bu durum pipetleme hatası, kontaminasyon veya reaktif bozulması gibi sorunlara işaret eder.
Ayrıca no template control (NTC) ve pozitif kontrol sonuçları da değerlendirmede önemlidir. NTC’de sinyal çıkmaması, sistemin kontaminasyondan arınmış olduğunu kanıtlar. Pozitif kontrol ise cihazın ve reaktiflerin düzgün çalıştığını doğrular.
Sonuçların Raporlanması ve Klinik Önemi
Real-Time PCR analizlerinde elde edilen Ct değerleri ve eğri formları, gen ekspresyon çalışmalarında ya da hastalık teşhislerinde sayısal veri sağlar. Bu sonuçlar doğrudan “pozitif” veya “negatif” olarak değil, genellikle “Ct değerine göre anlamlı pozitiflik” şeklinde raporlanır. Özellikle viral yük analizleri, gen ekspresyon karşılaştırmaları ve mutasyon tespitleri gibi alanlarda bu sonuçların doğru yorumlanması hayati önem taşır.
