Oligonükleotitler(primerler) laboratuvar ortamında kimyasal sentez yöntemi ile üretilebilen kısa DNA /RNA zincirleridir. Oligonükleotitler moleküler genetik çalışmalar, PCR yöntemi başta olmak üzere DNA’daki mutasyonları tanımlamak ve DNA zincirindeki baz dizilerini belirlemek için de kullanılmaktadır.
Uygun maliyetli ve yüksek verimli sentezlenen primerler kalite kontrol testine tabi tutulmaktadır. Oligonükleotid sentez prosesi, fosforamidit monomerlerle tetrazol katalizine dayanır.
Desalting/Standart Saflaştırma ( Tuzdan Arındırma )
Üretilen primerler rutin olarak tuzdan arındırma yöntemi ile saflaştırılmaktadır. Tuzdan arındırma işlemi, sentez sırasında oluşan tuzları temizlemek için kullanılır. Bu yöntem (n-1), (n-2) gibi kısa oligoları üründen uzaklaştırmaz. Bu yöntem, 35 baza kadar olan oligolar ve PZR uygulamaları için tercih edilebilir. Dizinin uzunluğu arttıkça elde edilen ürünün içinde kısa ürünlerin yüzdesi artar, bu nedenle 35 baz’dan uzun oligolar için OPC/HPLC saflaştırma tavsiye edilmektedir.
Kartuş bazlı saflaştırma ( OPC)
OPC yöntemi ile saflaştırılan oligolarda kısa diziler bulunmaz. Kullanılan oligodaki kısa dizilerin varlığının istenmediği dizileme, SNP analizi ve gen sentezi gibi yöntemler için OPC saflaştırma yöntemini tavsiye edilmektedir.. OPC saflaştırma, 60 baz uzunluğa kadar olan oligonükleotidler için yapılabilmektedir. 60 baz üzerindeki oligolarınız için HPLC saflaştırma tavsiye edilmektedir.
HPLC
HPLC yönteminde oligonükleotidler C18 kolondan geçiş sırasında kimyasal yapılarındaki farklılıklara göre (baz sayısı, modifiye kimyasal grupların varlığı/boya konjügasyonu gibi) ayrılırlar. Bu yöntem ile tüm kısa diziler uzaklaştırılarak en yüksek saflık derecesine sahip oligonükleotidler elde edilir. Klonlama gibi oligo dizilerinde yüksek doğruluk gerektiren uygulamalar için HPLC saflaştırma tavsiye edilmektedir. Ayrıca, modifiye oligo, Inozin’li oligo ve hidroliz probları gibi dizisinde rutin DNA bazları dışında gruplar olan oligonükleotidler için de mutlaka HPLC saflaştırma yapılmaktadır.
Saklama Koşulları
Sentezlenen primerler liyofilize (kurutulmuş) şekilde teslim edilmektedir. Kurutma işlemi öncesi, OD ve A260 değerleri hesaplanır ve stok çözeltisi üretmek için eklenecek gerekli TE veya H2O miktarı belirlenir ve bu bilgiler, ürün ile birlikte üretim raporu olarak teslim edilir. HPLC saflaştırma yapılan ürünler ile birlikte ürünlerin saflık analizini içeren HPLC raporu da teslim edilmektedir.
Ürünler liyofilize şekilde gönderildiği için gönderim esnasındaki sıcaklık farklarından olumsuz etkilenmemektedir. Teslim aldığınız ürünleri, daha uzun bir raf ömrü için, çözünmemiş haldeyken +4ºC/-20ºC’de saklamanız gerekmektedir. Çözünmüş primerler -20 °C’de küçük porsiyonlar halinde saklanmalıdır. Uzun süreli depolama için TE Buffer ile çözmeniz ve donma-çözülme döngülerinden kaçınmanız tavsiye edilmektedir.
Rutin olarak sentezlenen primer sklası;
- 50 nmol ( 100 bp uzunluğuna kadar)
- 100 nmol ( 100 bp uzunluğuna kadar)
- 200 nmol ( 100 bp uzunluğuna kadar) dur.
- İsteğinize bağlı olarak farklı saflaştırma teknikleri ile primer sentez işlemi yapılmaktadır.
